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農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的不確定性

現在作植物的轉殖,幾乎都是用農桿菌了。這個格蘭氏陰性(Gram negative)桿菌,原本是農作物的病菌,會導致植物產生腫瘤(crown gall);雖然植物的腫瘤不會轉移也沒有致命的風險,卻會使植物生產的養分,因為要供應給腫瘤而造成產量減少。

農桿菌所產生的腫瘤。圖片來源:wiki
農桿菌所造成的危害,最早是在葡萄裡面發現;後來慢慢發現它其實可以危害許多植物,不過在自然界中以雙子葉植物居多。農桿菌自己帶了一個質體,稱為Ti質體。這個Ti質體,在農桿菌感染植物時,其中有一段DNA會插入植物的基因體中。

這段DNA(稱為T-DNA)裡面帶有合成兩種植物賀爾蒙所需的酵素基因,進入植物基因體後,便會使得該植物細胞開始大量產生生長素(auxin)與細胞分裂素(cytokinin)。這兩種賀爾蒙相加的結果,會使得細胞開始分裂增生,於是就產生腫瘤了。當然,T-DNA中還有其他的基因,會驅使植物細胞合成農桿菌所需要的養分,包括了小分子氨基酸與磷酸化的糖類等,這樣農桿菌在腫瘤中才能生長壯大。

原本研究農桿菌是為了要打敗它,但是科學家在研究的過程中發現,這隻細菌非常的有意思。原來,農桿菌在將T-DNA轉入植物基因體時,根本不管裡面有什麼、也不管有多長(當然,太長了效率會降低),它只認這段DNA的兩邊邊界(稱為左右邊界),然後就一股腦地將左右邊界之間的DNA給塞進植物裡面了。

農桿菌的轉殖原理。左邊是農桿菌,右邊是植物細胞;
C為Ti質體,載體中的a為T-DNA。圖片來源:wiki
這樣有意思的轉殖過程,就讓科學家們想到,如果可以把T-DNA用自己想要放進植物裡面的基因給取代,是不是就可以把「任何基因」都給它放進去了呢?

理論上是這樣,不過因為Ti質體實在是太大了(大約200kb以上),造成在實驗室裡面的操作很困難。這個障礙,直到1983年 Hoekema 以及de Frammond這兩個研究團隊發現,可以把Ti質體一分為二之後,農桿菌才成為研究植物的人的心頭寶。

從此以後,農桿菌開始被大量用在製作轉基因植物上;原本是雙子葉植物的病原菌的它,經過研究團隊悉心調製配方以後,它現在已經可以說是少有敵手。跟基因槍相比,又不用買很貴的儀器、也不需要買金粉或鎢粉;只要把質體做好,塞到農桿菌裡面,養個一堆以後,把要轉的組織泡在裡面若干時間,就大功告成了!它能夠成為植物研究者的心頭寶,真的不是蓋的!

但是,它還是有一些限制。過去的研究發現,由於農桿菌只需要在植物基因體上找到很小一段序列相似,就可以進行轉殖;於是幾乎可以說,農桿菌在植物基因體中的「任何地方」都可以把T-DNA塞進去。這樣雖然很方便,但也有麻煩。有時它會破壞基因,造成植物產生一些特殊的性狀。

當然,那樣的基改植物,就不能使用了;雖然它還可以有其他的用途。不過,有另外一個疑問是:農桿菌真的有那麼「乖」,就只會把左右邊界之間的DNA塞進植物裡面而已嗎?

這個疑問,如果問早期研究植物的科學家,可能會被嗤之以鼻;他們會告訴你,當然!不過這個當然,在1990年代已經被打破了。

在1992年12月2日,當加基公司(Calgene Inc)正在為了它們的莎弗番茄(Flavr Savr Tomato)申請上市忙得天翻地覆時,收到了食品藥物管理局的來函,希望他們澄清一件事:是否真的只有T-DNA的序列嵌入番茄中?

原本加基公司也認為食品藥物管理局未免多此一問,但等到南方墨點試驗(Southern Blot)出爐,他們很驚訝地發現:約有20%-30%的農桿菌載體序列也出現在植物中(1)。於是他們只得將這些含有農桿菌載體序列的番茄剔除。

後來,Neal Gutterson等人也發現,農桿菌的載體序列的確會出現在基改植物中;而且比例高於加基公司所做出來的結果(50%~80%)。不過,Gutterson的研究團隊,後來便在載體中放了一個致死基因,只要轉殖過程中把包含了致死基因的載體序列放進去了,植物便會死亡(2)。

看起來似乎額外的序列加入植物的問題解決了,但筆者過去的經驗發現,農桿菌有時會只嵌入短短的序列(只有幾個或十幾個鹼基對),這短短的序列,如果插入基因中,仍足以破壞蛋白質的產生,或是打亂基因的表現;可是這樣短的序列,卻無法以南方墨點試驗鑑定,嵌入致死基因也無法預防這樣的事情發生...所以,究竟農桿菌用來轉殖,是否真的是安全的?除卻定序整個基因體(需要相當高的經費)之外,通常都是由檢驗外觀性狀以及基改植物各大小分子的表現量是否異於原植物而已。

所以,是否安全呢?筆者也沒有答案,您呢?

(台大科教中心擁有此文版權,其他單位需經同意始可轉載。)

參考文獻:

1. Belinda Martineau. 番茄一號-全球第一個上市基改食品「莎弗番茄」的起與落。遠流出版。

2. Bill Hanson, Dean Engler, York Moy, Bob Newman, Ed Ralston and Neal Gutterson. 1999. A simple method to enrich an Agrobacterium-transformed population for plants containing only T-DNA sequences. The Plant Journal. 19(6):727–734.

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