藍光（blue light）秘密：揭開大豆葉片衰老的神秘面紗

 

大豆。圖片來源：維基百科

雖然紅光對光合作用很重要，所以植物有光敏素（phytochrome）來偵測紅光，但是植物不只會看見紅光與紅外光，也會看見藍光。藍光可以影響植物的發育，包括趨光性與開花。藍光受器稱為隱花色素（cryptochrome，CRY ）。

最近針對大豆的隱花色素進行的研究發現，大豆中的隱花色素 GmCRY1b 參與調節大豆葉片的衰老過程。研究團隊發現， GmCRY1b 能夠與 DELLA 蛋白質 GmRGAa 和 GmRGAb 進行互動，並通過調節 GmWRKY100 基因的轉錄來影響大豆葉片的衰老。此外，研究團隊還發現，GmRGAa 和 GmRGAb 蛋白質的表現量在藍光照射下明顯下降，這顯示它們可能參與了  GmCRY1b 調節大豆葉片衰老的過程。這些發現有助於深入了解植物葉片衰老的調節機制，並為進一步研究植物的生長和發育提供了重要的參考。

研究團隊為了要瞭解隱花色素在大豆中的角色，他們進行了多個實驗。

他們使用兩層黃色濾光片來模擬低藍光（LBL）條件，而同一株幼苗的另一片對面的單葉則被覆蓋了兩層透明濾光片，作為對照組。這樣的實驗設計旨在模擬不同藍光强度下的條件。

研究團隊發現，接受低藍光（LBL）處理的葉片顯著地加速衰老，其葉綠素含量較低，而衰老標記基因GmSAG12、GmSAG13和GmSAG113的表現量較對照組更高。在低藍光下若再提供紅外光，葉片顯示出更加明顯的衰老。這些結果顯示，LBL是大豆中促進葉片衰老的重要遮蔭信號，並且通過一個獨立的途徑與紅外光一起誘導葉片衰老。

接下來，研究團隊想知道大豆的隱花色素是否參與調節大豆中的光誘導葉片衰老。大豆有四個CRY1和三個CRY2。他們使用CRISPR技術生成了CRY1四重突變株（Gmcry1s-qm）和CRY2三重突變株（Gmcry2s-tm）。在長日照和自然田間條件下，無論是CRY1四重突變株還是CRY2三重突變株都比野生型衰老得更快。CRY1四重突變株的葉綠素含量明顯下降，子葉和葉片衰老指數較高，衰老標記基因的表現量也較高，比CRY2三重突變株更明顯，這顯示大豆的隱花色素在控制大豆葉片衰老中發揮主導作用。相反的，高量表現 GmCRY1b表現出較緩慢的葉片衰老。

為了瞭解CRY1s抑制葉片衰老的分子機制，研究團隊使用酵母雙雜交（Y2H）系統來找尋它潛在的互動伙伴。他們發現大豆的 GmCRY1b 與 DELLA 蛋白質 GmRGAa 和 GmRGAb 在藍光下發生互動，且需要藍光，不過在低藍光（LBL）下觀察不到這種互動。進一步的研究確定了  GmCRY1b 與 GmRGAa 交互作用的區域，是 大豆的GmCRY1b 的中間部分的 33 個胺基酸。

這種 GmCRY1b和DELLA蛋白之間的藍光依賴性互動在大豆葉片的雙分子螢光互補（BiFC）實驗中進一步得到證實。BiFC信號主要發生在細胞核內，顯示 GmCRY1b和DELLA蛋白在細胞核中佔據相同的位置，這暗示著GmCRY1b-DELLA複合體在細胞核中的功能。這些發現顯示大豆 GmCRY1b 與 DELLA 蛋白質之間存在一個藍光調節的互動，這可能是調節大豆葉片衰老的重要機制之一。

由於DELLA蛋白也在GA信息傳導中擔任重要角色，這是否意味著GA在大豆中也與衰老相關呢？研究團隊對幼苗進行了GA3或PAC（paclobutrazol）處理後發現，GA3加速了葉片衰老，而PAC延緩了葉片衰老。此外，高度表現GA2ox-7a，該基因能夠使生物活性的GA失去活性，也顯示出較緩慢的衰老，意味著GA是大豆中促進衰老的激素。

研究團隊也發現GA可以在CRY1四重突變株中誘導顯著的衰老，這顯示CRY1s抑制了大豆中GA引發的衰老。進一步的分析顯示， GmCRY1b在藍光下穩定了GmRGAa和GmRGAb，並在LBL處理時釋放了GmRGAa和GmRGAb的分解。

為了確定DELLA蛋白在調控大豆葉片衰老中的作用，研究團隊使用CRISPR剔除了GmRGAa和GmRGAb基因。儘管單突變株並未表現出明顯的衰老，但與野生型相比，雙突變株表現出明顯的早衰，包括較低的葉綠素含量、較高的子葉和葉片衰老指數，以及較高的SAGs基因表現量，而GmRGAb-OE株在自然田間條件下呈現較緩慢的葉片衰老，顯示GmRGAa和GmRGAb在葉片衰老中發揮了負面作用。

為了探討GmRGAa和GmRGAb在LBL誘導的葉片衰老中的作用，研究團隊將Gmrgaa-1、Gmrgab-1和雙突變株幼苗進行LBL處理。分析顯示，與野生型相比，由LBL誘導的葉綠素含量降低逐漸減少在Gmrgaa-1、Gmrgab-1和雙突變株中。這與LBL促進GmRGAa和GmRGAb分解的事實相符，顯示在大豆中，LBL至少部分通過降低GmRGAa和GmRGAb蛋白來觸發葉片衰老。

為了進一步解析CRY1s主導的葉片衰老信息傳遞，研究團隊分析了野生型、CRY1四重突變株和GmCRY1b-OE株之間的差異表現基因（DEGs），發現CRY1四重突變株和GmCRY1b-OE株相對於野生型的DEGs分別有3055和638個，其中有249個基因在CRY1四重突變株和GmCRY1b-OE株相對於野生型表現出相反的模式。分析後發現，其中有14個與葉片衰老相關的基因，包括編碼WRKY轉錄因子、MYB轉錄因子、SEN4、半胱胺酸蛋白酶和B-BOX域蛋白的基因，包括了典型的WRKY轉錄因子GmWRKY100，在GmCRY1b-OE株中表現量下降，在CRY1四重突變株中則上升，這顯示GmWRKY100可能在CRY1s主導的葉片衰老調節中發揮作用。

值得注意的是，隨著葉片衰老的進展，GmCRY1b、GmRGAa和GmRGAb的表現量也增加，顯示在葉片衰老過程中存在CRY1s、DELLAs和GmWRKY100之間的負回饋調節。為了驗證這一點，研究團隊使用CRISPR生成了GmWRKY100突變株。與野生型相比，這些突變株在溫室和自然田間條件下呈現出較緩慢的葉片衰老，葉綠素分解速度較慢，子葉和葉片衰老指數較低。低藍光處理顯著誘導了GmWRKY100的表現，而在連續白光下其表現保持不變。

為了確定GmWRKY100在LBL誘導的葉片衰老中的作用，研究團隊分別在白光和LBL條件下培養了野生型植物和Gmwrky100突變株。分析顯示，在Gmwrky100突變株中，與野生型相比，LBL誘導的葉片衰老減少。這些結果顯示，GmWRKY100基因在LBL誘導的葉片衰老中發揮著重要作用。

既然GmRGAa和GmRGAb延遲葉片衰老，而GmWRKY100促進葉片衰老，那麼GmWRKY100的轉錄會不會受到GmRGAa和GmRGAb的負調控呢？分析發現，與野生型相比，Gmrgas-dm突變株的GmWRKY100 mRNA增加了20倍以上。此外，處理10 μM GA3顯著增加了GmWRKY100 mRNA量。然而，在CRY1四重突變株中，GA誘導的GmWRKY100表現被干擾。另一方面，高量表現GmGA2ox7a使GA失去活性，導致GmWRKY100轉錄下降，意味著DELLA蛋白可以抑制GmWRKY100的表現。進一步的測試也顯示，DELLA蛋白的確可以直接抑制GmWRKY100的轉錄。

有趣的是，DELLA蛋白對GmWRKY100轉錄活性的抑制作用在LBL條件下減弱。這些結果共同暗示了一件事：LBL觸發DELLA蛋白的分解，導致GmWRKY100的轉錄增加，從而促進大豆的葉片衰老。由於DELLA蛋白缺乏標準的DNA結合區域，因此可能存在未知的轉錄因子在調節GmWRKY100啟動子的活性方面發揮作用，而DELLA蛋白則通過與這些因子互動來充當抑制劑。

此外，Gmwrky100突變株在自然田間條件下，與野生型相比，每株豆莢數增加了11％，而每百粒重量未發生變化。此外，生長階段在野生型植物和Gmwrky100突變株之間沒有顯著差異，這顯示Gmwrky100突變株中產量增加可能是由於大豆的葉片衰老延遲和光合作用時間延長所致。

當植物處於其他植物的陰影之下，植物會長得越來越長、葉片變得小而淡綠。如果光線的狀況不改善，植物就會提早開花提早死亡。過去認為是因為光敏素，但這個研究讓我們了解到，隱花色素也擔任了重要的角色。

參考文獻：

Li, Z., Lyu, X., Li, H. et al. The mechanism of low blue light-induced leaf senescence mediated by GmCRY1s in soybean. Nat Commun 15, 798 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-45086-5