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植物的間諜包裹：細胞外囊泡

 

圖片來源：Cell Host & Microbe

看過灰黴病菌（Botrytis cinerea）嗎？你一定看過，只是你不知道。灰黴病菌是非常常見的植物病原菌，會造成灰黴病。寄主範圍寬廣，主要發生於冬春季低溫多濕季節，24℃以下低溫才會發生，尤以初春春雨來臨時發生嚴重。

這篇論文的主題是關於植物的mRNA如何通過細胞外囊泡（EVs）進入真菌病原體，從而降低感染。研究團隊發現，阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）能將mRNA通過EVs傳遞到灰黴病菌中，這些mRNA在真菌細胞內被轉譯成蛋白質，這些蛋白質能夠減少對植物的感染。

研究團隊的主要發現包括：

1. 植物EVs能夠攜帶mRNA：研究顯示，植物EVs中含有mRNA，並且這些mRNA與生物防禦反應有關。

為了確認植物細胞外囊泡（EVs）中含有mRNA，研究團隊對從阿拉伯芥葉子的葉間液中早期（16小時）收集的純化EVs進行了mRNA分析。在對照組和灰黴病菌感染的葉子分離的EVs中，通過RT-PCR檢測到全長植物mRNA。針對幾種基因（如衰老相關基因21（SAG21）、ATP硫酸轉運酶1（APS1）、過氧化物酶IIC（PRXIIC）和類Hevein（HEL））的全長mRNA，在經過微球菌核酸酶和蛋白酶K消化後，除非先用Triton X-100破壞囊泡，否則仍然可以在純化的EVs中被檢測到。這證明這些mRNAs確實包含在囊泡內部，而不是結合在外表面或與獨立的蛋白聚合物相關聯。

2. 植物mRNA在真菌細胞中被觀察到：利用螢光RNA適配体（Broccoli system）證實了在EVs中的植物mRNA可以被真菌細胞攝取。

螢光RNA適配體（Fluorescent RNA Aptamers）是一種特殊的RNA分子，它們通過高通量篩選（如SELEX）從大量的隨機序列庫中篩選出來。這些RNA適配體具有獨特的結構，使它們能夠緊密結合特定的螢光分子（如螢光染料），從而在特定條件下發出螢光。

這些螢光RNA適配體可以用於標記和追踪RNA分子。其中一個著名的例子是“Broccoli”系統，這是一種螢光RNA適配體，能夠緊密結合DFHBI這種螢光分子。當Broccoli適配體與DFHBI結合後，在藍光激發下會產生綠色螢光，從而使研究人員能夠在活細胞中直接觀察到RNA分子。

3. 植物mRNA在真菌細胞內被翻譯：通過轉錄體親和純化（TRAP）技術，研究者發現植物mRNA在真菌細胞中與多聚體結合，表明這些mRNA在真菌細胞內被積極轉譯。

在論文中，確認植物mRNA在真菌中被轉譯的實驗主要包括以下步驟：

研究團隊透過RT-PCR結果顯示，SAG21和APS1這兩種基因的mRNA在含有多聚體的分離物中聚集。為了進一步確認SAG21和APS1在活躍轉譯的多聚體中累積，他們將真菌細胞裂解液處理了轉譯抑制劑puromycin，然後以蔗糖梯度離心。結果SAG21和APS1植物mRNAs與Bc_Actin（灰黴病菌內源對照轉錄本）一樣，轉移到較慢沉降的單體分子的梯度部分，這顯示轉運的植物mRNAs與活躍轉譯的真菌多聚體相關，因此在真菌細胞內轉譯成蛋白質。

另外，研究團隊還使用轉錄體親和純化分析（TRAP）來檢測真菌細胞中的植物mRNAs。全長植物mRNA在TRAP分離的真菌核糖體部分中被檢測到，這進一步證明了這些mRNAs與真菌核糖體相關，並且在感染過程中被轉譯。

研究團隊還進行了定量分析，以確定從轉移的植物YFP標記mRNA中在真菌菌絲中轉譯出蛋白質。RT-PCR顯示，全長YFP標記的野生型SAG21和APS1以及YFP標記的突變mSAG21和mAPS1在與EVs共培養24小時的真菌細胞中被檢測到。然而，只有轉移的野生型SAG21和APS1 mRNAs而不是突變版本被轉譯成在真菌細胞中標記的蛋白質。

這些實驗結果共同證實了植物mRNA在真菌細胞內的確被轉譯成蛋白質。

4. 植物mRNA在真菌細胞內降低感染：透過在灰黴病菌中異位表達這些植物mRNA編碼的蛋白質，發現這些蛋白質能降低對拟南芥的感染能力。

為了確認植物mRNA的蛋白質產物能降低真菌對阿拉伯芥的感染能力，研究團隊在灰黴病菌中異位表達了帶有YFP標記的阿拉伯芥SAG21和APS1基因。這是通過在灰黴病菌基因組的一個間隔區域下游使用一個構成性啟動子（oliC）進行的。

研究團隊比較了表達SAG21-YFP和APS1-YFP的B. cinerea轉化株與表達突變型mSAG21-YFP或mAPS1-YFP以及控制的免費YFP轉化株對阿拉伯芥的感染能力。結果顯示，表達SAG21-YFP和APS1-YFP的轉化株對阿拉伯芥的感染能力顯著降低，而表達突變型轉錄本的轉化株與僅表達YFP的控制轉化株在感染方面沒有顯著差異。

這些結果確認了這些轉移的mRNAs在轉譯成蛋白質後可以抑制病原體感染，從而顯示植物透過細胞外囊泡將mRNAs轉移到真菌病原體中，並通過這些mRNAs的蛋白質產物抑制感染的機制。

總而言之，這項研究展示了植物如何利用EVs作為一種機制，將mRNA轉移到病原體中，進而抑制對植物的感染。這一發現不僅提供了對植物與病原體交互作用更深一層的理解，也為開發新的植物病害防治策略提供了潛在途徑。

參考文獻：

Shumei Wang, Baoye He, Huaitong Wu, Qiang Cai, Obed Ramírez-Sánchez, Cei Abreu-Goodger, Paul R.J. Birch, Hailing Jin. Plant mRNAs move into a fungal pathogen via extracellular vesicles to reduce infection. Cell Host & Microbe, 2023; DOI: 10.1016/j.chom.2023.11.020
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